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超详细！手把手教你做 RNA pull down、RIP（图文并茂，提供完整讲座、直播回放）
人阅读 发布时间：2023-12-11 11:42
RNA pull-down 作为研究 RNA 与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。RNA pull down 是使用体外转录法标记生物素 RNA 探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过 WB 实验检测特定的 RNA 结合蛋白是否与 RNA 相互作用，或者结合 MS 筛选 RNA 结合的未知蛋白。
一、RNA pull down 实验步骤
• 构建 RNA 过表达质粒：基因合成 +测序验证；
• 体外转录模板准备：设计含 T7 启动子引物，PCR 扩增得到转录模板；
• 体外转录：以 PCR 产物为模板，体外转录得到目的 RNA；
• RNA pull down ：通过磁珠 -RNA 探针复合物富集互作的蛋白；
• 银染质检：SDS -PAGE 电泳银染检测富集蛋白的情况 ；
• 质谱鉴定：通过质谱鉴定实验组与对照的差异蛋白；进而筛选可能的互作蛋白。
1、构建 RNA 过表达质粒
① 首先通过其他手段筛选确定自己感兴趣的 RNA（以下讲解 lncRNA 为 主）；检索数据库找到对应的 RNA 碱基序列；
② 再通过 RACE 扩增是否存在未知序列，由于 lncRNA-RACE 成功率非常低， 尝试扩增后再确定 RNA pull down 使用的序列；
③ 确认 RNA pull down 使用的序列后，设计引物全基因合成目 RNA 序列， 构建到 pcDNA3.1（载体可以根据其他实验灵活替换）过表达中，并测序验证序列准确性；
④ 最后提取过表达质粒备用。
2、体外转录模板准备
实验分组：
实验组：sense 链即目的 RNA 序列
对照组：antisense 链即目的 RNA 互补序列
引物设计方法：
在正向引物前面加入 T7 启动子序列；反向引物不变。
以构建过表达质粒为模板 +设计合成好的引物，扩增得到体外转录模板，琼脂糖凝胶电泳检测扩增 PCR 产物情况，切取目的条带纯化回收备用。
3、体外转录
① 以纯化回收的 PCR 产物作为转录模板，用体外转录试剂盒进行转录得到目的 RNA（含 sense 及 antisense 两组）；
② 不同试剂盒转录情况（转录 RNA 大小、转录 RNA 量等等）会有所不同。
4、RNA pull down
① 蛋白液提前准备：
优先选择细胞系：pull -down 实验前需要提供对应的细胞系，扩大培养后收集细胞裂解提取总蛋白备用；
组织样品作为备选：动物或者植物组织液氮研磨后超声裂解提取总蛋白备用。由于组织样品需要前处理，且其中包含很多杂质可能会对磁珠富集产生影响，最终影响富集效率导致富集蛋白量较少，进而影响最终鉴定结果。
② 以上体外转录得到的 RNA ，标记生物素后纯化备用；
③ 标记生物素 RNA 探针与链霉亲和素磁珠共孵育形成复合物；
④ 生物素 RNA 探针 -链霉亲和素磁珠复合物富集蛋白；
⑤ 富集蛋白洗脱保存。
5、银染
电泳→固定→致敏→染色→显色→终止
6、质谱鉴定
RNA pull down 富集蛋白质谱通常选择胶条鉴定。
根据银染结果来选择质谱鉴定的方式：
A、存在肉眼可见差异条带：
切取 sense 实验组泳道中的差异条带进行胶鉴定。当差异条带非常多时，节约质谱费用也可以选择 sense 和 antisense 两组蛋白液分别进行质谱。
B、无肉眼可见差异条带：
将 sense 实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定，根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白，进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。
C、存在浓度差异条带：
也将 sense 实验组和 antisense 对照组两蛋白液分别进行全谱鉴定， 根据鉴定分析结果找出 sense 实验组中特有的蛋白，进而筛选与自己研究相关的蛋白进行后续验证。
7、验证实验
根据 RNA pull -down 质谱鉴定分析结果，筛选与自己研究相关的可能互作蛋白。
购买对应蛋白 IP 级别抗体；或者构建标签重组过表达质粒 /慢病毒处理细胞。使用目的蛋白抗体或者标签进行 RIP -QPCR 实验反向验证。
二、RNA pull down 技术应用
癌症肿瘤相关调控机制研究
LncRNA 发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA 和 RNA 相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥 ceRNA、增强子 RNA 作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。
lncRNA 能够通过对肿瘤细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂类代谢途径中的关键环节进行调节，导致肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加、谷氨酰胺分解增强及脂质生成增加，从而促进肿瘤的发生和发展。目前，大多数 lncRNA 在肿瘤细胞能量代谢中的功能和调控机制尚不完全清楚，进一步认识和了解肿瘤细胞中与 lncRNA 相关的能量代谢异常表现出的恶性生物学行为，将有助于为肿瘤的诊断和治疗提供有效的证据及新的思路和途径。
环状 RNA（circular RNA，circRNA）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码 RNA。研究发现，circRNA 在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程。
circRNA 大多由外显子序列组成，呈闭合环状结构，性质稳定，高度保守性，通过微小 RNA「海绵」作用调控靶基因表达，与肿瘤的发生、发展相关。这些特性使 circRNA 有潜力成为肿瘤新型分子诊断标志物。通过竞争性与肿瘤相关微小 RNA 的结合，可以开发针对 circRNA 分子靶点的靶向治疗药。因此,circRNA 在肿瘤转化医学研究中意义巨大。
多种人类疾病研究
RBPs 在转录后水平参与调控 mRNA 稳定性、LncRNA 活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对 RBPs-RNAs 相互作用网络的研究和鉴定有重要意义。但由于 RBPs 作用方式复杂、功能多样性、作用空间位置多样化等原因，对其开展精确研究一直是一个重大挑战。RNA 领域，尤其是非编码 RNA 研究的快速发展，催生了多种 RBPs-RNAs 相互作用鉴定技术。
三、RNA pull- down 实验常见问题
1、RNA 结合蛋白的亲和力不够
可能的原因：1) 结合缓冲环境没有优化；2) 裂解不完全；3) 磁珠用量不足；4) RNA 探针用量不足
解决方案：1) 优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；2) 增加裂解液和蛋白上样量的比例；3) 增加裂解液；4) 增加磁珠或探针用量；5) 确定生物素和涟霉亲和素效率
2、RNA 结合蛋白没有结合
可能的原因：1) 靶蛋白量不足；2) 缓冲体系不对；3)RNA 探针和蛋白的亲和力本来就低
解决方案：1) 增加上样蛋白量；2) 应用低盐体系；3) 加入交联试剂
3、WB 信噪比高
可能的原因：1) 阳性信号率低；2) 一抗效率低；3) 蛋白没有充分沽解
解决方案：1) 增加抗的量；2) 用敏感度的化学发光液；3) 用细胞裂解液预孵-抗；4) 增加样品的量；5) 确定有没有其他可能的结合情况；6) 增加裂解液用量
4、结合的非特异性高
可能的原因：1) 缓冲环境没有优化；2) 缓冲环境严谨性低；3) 样品没有裂解完全和裂解体系没有优化
解决的方案：1) 优化孵育时间温度盐浓度等条件；2) 使用严谨性高的缓冲体系；3) 调低 RNA 探针和样品的比例；4) 提高裂解液的量
四、案例展示
1、RIP简介
RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 结合蛋白免疫沉淀）主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者测序分析。RIP 是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，可以帮助我们发现miRNA的调节靶点。
2、RIP的技术优势
● 高灵敏度和高特异性：RIP技术能够高度富集RNA和与之相互作用的蛋白质，具有较高的灵敏度和特异性
● 低样本量要求：RIP技术可以在较少的细胞或组织样本中进行实验，减少实验成本和样本需求
● 适用于多种RNA种类：RIP技术适用于不同类型的RNA研究，包括长链非编码RNA和编码RNA
● 不需要事先了解RNA-蛋白质相互作用的信息：可用于探索未知的RNA-蛋白质相互作用
● 可量化分析：RIP技术可以进行定量分析，评估不同条件下的相互作用的强度和稳定性
● 结合其他技术的联合应用：RIP技术可以与其他技术相结合，如RNA测序、蛋白质组学和转录组学等，进行综合分析，深入揭示RNA-蛋白质相互作用的功能和调控机制
3、RIP技术的实验步骤
● 细胞提取：从细胞中提取总蛋白质，包括RNA结合蛋白质
● 免疫共沉淀：将提取的细胞蛋白质与特异性抗体结合，形成免疫复合物
● 沉淀：使用蛋白A/G磁珠等具有亲和性的材料，将免疫复合物沉淀下来
● 洗涤：通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质
● 逆交联：将免疫复合物与RNA解离，并逆交联，释放RNA分子
● RNA提取：从逆交联的样品中提取RNA
● 分析：对提取的RNA进行定量PCR、RNA测序或其他RNA分析方法，用于鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质
4、RIP技术的应用
● RNA调控网络的研究：RIP技术可以帮助我们揭示RNA-蛋白质相互作用在基因调控中的作用。通过鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质，我们可以了解RNA的转录、剪接、稳定性和翻译等方面的调控机制，从而揭示RNA调控网络的复杂性和动态性。
● 疾病相关的RNA-蛋白质相互作用研究：RIP技术可以用于研究与疾病相关的RNA-蛋白质相互作用。通过比较疾病样本和正常样本中的RNA-蛋白质相互作用，我们可以发现与疾病发生和发展密切相关的RNA-蛋白质相互作用，从而提供新的疾病诊断和治疗靶点。
● 新型RNA结合蛋白质的发现：RIP技术可以帮助我们发现新的RNA结合蛋白质。通过鉴定与特定RNA相互作用的蛋白质，我们可以发现那些在传统方法中未被发现的RNA结合蛋白质，从而揭示更多未知的RNA功能和调控机制。
● RNA-蛋白质相互作用在药物研发中的应用：RIP技术可以在药物研发过程中发挥作用。通过研究特定药物对RNA-蛋白质相互作用的影响，我们可以评估药物的效果和安全性，为药物研发提供重要的信息和指导。
5、RIP实验结果不如预期如何优化
（1）低信号强度：如果RIP实验的信号强度较低，可能是由于以下原因：
▶ 优化抗体浓度：尝试调整抗体的浓度，增加或减少抗体的用量，以获得更好的信号与噪音比。
▶ 增加孵育时间：延长孵育时间可以增加目标RNA和蛋白质的结合，从而提高信号强度。
▶ 优化实验条件：调整反应温度、缓冲液成分等实验条件，以最大化结合效率。
（2）高背景噪音：如果RIP实验存在较高的背景噪音，可能需要考虑以下优化措施：
▶ 优化洗涤步骤：增加洗涤步骤的次数和强度，以有效去除非特异性结合物质，减少背景噪音的干扰。
▶ 优化抗体选择：确保选择具有较低非特异性结合能力的抗体，以减少背景信号。
▶ 增加阴性对照：引入适当的阴性对照，如使用非特异性抗体或非相关RNA序列，以帮助区分真实信号和背景噪音。
（3）非特异性结合：如果RIP实验存在非特异性结合问题，可以尝试以下优化策略：
▶ 优化洗涤条件：增加洗涤缓冲液的浓度和洗涤时间，以更彻底地去除非特异性结合物质。
▶ 使用更严格的阴性对照：选择更具特异性的阴性对照，确保它与目标RNA不存在相互作用。
▶ 预实验和对照实验：进行预实验和对照实验，以验证特异性结合并排除非特异性结合的影响。
（4）结果不一致或不可重复：如果RIP实验结果在重复实验中存在不一致或不可重复的问题，可以考虑以下优化措施：
▶ 增加实验重复次数：增加实验的重复次数，以提高结果的一致性和可靠性。
▶ 核对实验步骤：仔细核对实验步骤，确保实验操作的一致性和准确性。
▶ 校准实验条件：重新校准实验条件，包括反应时间、温度和孵育条件等，以确保实验的可重复性。
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