人类疾病往往并非由容易追踪的单一基因变异导致，大多数疾病例如心脏病、癌症或者精神疾病都源自许多不同基因与彼此以及环境之间的复杂互动。分子互作研究（核酸与核酸、核酸与蛋白、蛋白与蛋白）是疾病机制研究的重要组成部分，是功能、表型研究的进一步深化。
 

蛋白质是生命体的重要组成部分，是生命活动的主要承担者和执行者。据估计，超过 80% 的蛋白质并不是孤立存在，而是与其他蛋白质通过相互作用形成稳定或瞬时的复合物结构。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPIs）是分子生物学中最重要的现象之一，几乎在所有的生命过程中（如细胞通讯、代谢、转运、信号转导、免疫应答和基因转录）都起着核心作用。因此，对蛋白质-蛋白质相互作用的研究，已成为生命科学研究的热点之一。

研究蛋白质-蛋白质相互作用的常用实验技术包括 GST pull down、Co-IP 和酵⺟双杂交等，在之前的文章中已经对 GST pull down 和酵母双杂交进行了深入讲解，错过的小伙伴可点击蓝字查看，本期小编将着重介绍 Co-IP 技术的方方面面，帮助大家更好地理解和运用这些技术手段。

 

Co-IP

1、技术原理
免疫共沉淀是利⽤抗体特异性反应纯化富集⽬的蛋⽩的⼀种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白 A/G（ProteinA/G）偶联的 Agarose 或 Sepharose 珠子孵育，通过离心得到珠⼦-蛋白 A/G-抗体-目的蛋白复合物（若用 MagBeads 则通过磁力分离得到珠子-蛋白 A/G-抗体-目的蛋白复合物），在⾼温及还原剂的作⽤下，抗原与抗体解离，收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

 

2、技术流程

 

3、常见问题与解析
 
Q1：通过 Co-IP 后 WB 验证发现，没有想要的目的条带？

• 1）有可能是样品被蛋⽩酶降解，对应的策略是需要添加蛋⽩酶抑制剂，所有操作保持 4℃ 以下冰上操作并防止冻融。
• 2）有可能是抗体浓度太低导致条带较浅，则需要调整 IP 或 WB 抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度。
• 3）抗体亲和力太低，选⽤适合于 IP 或者 WB 的抗体。
• 4）有的 IP 抗体未与磁珠结合，这种情况需选用适合 IP 的磁珠。
• 5）若 Tag 未暴露在融合蛋白构象的表⾯，则需改变 Tag 融合表达部位。
• 6）裂解液盐碱度太⾼，需用低盐碱度的裂解液。
• 7）抗体选择不当，更换抗体。

Q2：通过 Co-IP 后 WB 验证发现，虽然可见目的条带，但是背景很高，原因是什么？
A2：是由多方面原因造成的：
1）由于非特异蛋白结合导致背景高，若要避色非特异性蛋白结合，则需要在无血清溶液中裂解细胞，且在免疫沉淀前用 protein(A/G) 珠⼦预洗，在免疫沉淀后增加漂洗次数和盐碱度 (⾼盐或去垢剂)。
2）实验仪器或试剂被污染，使用洁净的仪器及试剂。
3）转移膜上的非特异吸附导致背景⾼，实验操作过程中戴⼿套，使⽤镊子来取，不要接触膜转移⾯。
4）制备样品中可能有不完全溶解的⼤的蛋白复合体，则在制备样品后进行短暂超声处理 (3 次，每次 5 秒钟)，然后离心，取上清后进行后续试验。
5）洗涤不彻底，则需要多次洗涤，并增加洗涤液中的 NaCl 和去垢剂浓度。
6）可能有非特异性蛋白吸附于珠⼦上，则须进行 Preclearing 以排非特异性吸附。
7）抗体本⾝待异性不好可能导致背景高，则须选择合适的抗体，可以考虑单抗。
8）使⽤了过多的细胞或组织进⾏裂解导致背景高，则须减少样本量，推荐 100-500 μg 细胞裂解液。
9）蛋⽩降解也可能出现高背景的情况，尽量使⽤新鲜制备的样品。
 

染色质免疫共沉淀技术（ChIP）

染⾊体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是用来研究蛋白质与 DNA 是否在体内存在相互作用，这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某⼀特定位置会出现何种组蛋白修饰。利⽤抗体抗原特异性结合，将与目的蛋白相结合的 DNA 片段沉淀下来，能够真实地反映结合在 DNA 序列上的调控蛋白。

A2：1）有符合要求的片段也有⽐较集中⽆法超声的⼤片段，可能是交联温度过⾼，交联时始终保持温度低于 25℃，尤其是夏天温度较高可将试剂和样本放置空调出风口⼀段时间再进⾏操作；2）片段很集中且小于 200bp，超声功率和时间不合适，需要做预实验探索最佳超声条件。

参考文献
http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10251-1017040424.htm
https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/hxjz200403011
https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/shdxxb202101010
10.3321/j.issn:1005-281X.2004.03.011

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