RNA-蛋白互作研究全景解析：从circPOLR2A案例看机制探索之路

在生命科学的微观世界中，RNA与蛋白质的相互作用是调控基因表达、影响细胞命运的关键环节。从转录后调控到信号转导，从发育生物学到疾病发生，RNA-蛋白互作的研究正成为解析生命机制的重要突破口。

近年来，随着环形RNA（circRNA）、m6A修饰等研究的突破，RNA-蛋白互作的研究方法与技术路径也日益成熟。今天，我们将以一篇发表于顶刊《Molecular Cancer》 的经典研究《Circular RNA circPOLR2A promotes clear cell renal cell carcinoma progression by facilitating the UBE3C-induced ubiquitination of PEBP1 and, thereby, activating the ERK signaling pathway》 为例，系统拆解如何从零开始，揭示其背后的技术逻辑与科学价值，将简单的“结合”关系，升华为一个完整的致病故事。

RNA结合蛋白（RBP）通过与特定RNA结合，调控其稳定性、定位、翻译甚至降解，进而影响细胞功能。在许多疾病中（如癌症、神经退行性疾病），RNA-蛋白互作的异常往往是致病的关键机制之一。

以circPOLR2A在肾透明细胞癌（ccRCC）中的研究为例：该circRNA通过结合UBE3C和PEBP1蛋白，形成三元复合物，促进PEBP1的泛素化降解，从而激活ERK信号通路，推动肿瘤进展。这一机制的揭示，不仅深化了我们对circRNA功能的认识，也为癌症治疗提供了新靶点。

生物信息学分析：通过GEO、TCGA等数据库筛选差异表达的RNA分子。

实验验证：使用qRT-PCR、Northern Blot、RNA-FISH等技术在组织与细胞中验证其表达与定位。

例如，circPOLR2A通过生物信息学筛选并在32对ccRCC组织中验证其高表达。

图1.调控异常的环RNA的剖析及cRCC中circPOLR2A异常表达的验证

Sanger测序：展示了circPOLR2A源自POLR2A基因的反向剪接，并通过测序峰图确认了其独特的背接位点（图2a）

RNase R耐受实验：确认circPOLR2A对核酸外切酶的抵抗能力（图2c, d）。

放_线_菌_素_D实验：评估circPOLR2A的半衰期与稳定性（图2e, f）。

定位分析：通过核质分离和RNA荧光原位杂交（FISH），证实circPOLR2A主要定位于细胞质，为其在细胞质中行使蛋白互作功能提供了舞台（图2g-i）。

图2.circPOLR2A的特征分析

这是整个研究的核心环节，旨在回答circPOLR2A与哪些蛋白结合？通过“体外” Pull-Down与“体内” RIP相互印证，结合“原位”共定位， 构建了RNA-蛋白互作的铁三角证据链，结论坚实可信。

❖技术组合拳之一：RNA Pull-Down + 质谱分析

方法：设计生物素标记的circPOLR2A特异性探针和阴性对照探针，与细胞裂解液共孵育，拉取与circPOLR2A直接结合的蛋白，然后通过银染和质谱分析进行筛选。

关键结果：

银染图显示有特异性条带被circPOLR2A探针拉下（图3a）。

质谱鉴定出301个候选互作蛋白。通过与临床预后数据库（CPTAC）进行交叉分析，最终锁定PEBP1和UBE3C等关键蛋白进行后续研究（图3b）。

❖技术组合拳之二：RNA免疫共沉淀（RIP）

方法：使用PEBP1或UBE3C的特异性抗体，在细胞内源性环境下捕获与其结合的RNA，再通过qRT-PCR检测circPOLR2A是否被富集。

关键结果：

结果表明，与对照IgG组相比，PEBP1和UBE3C抗体能显著富集circPOLR2A，从反面验证了它们的结合。

❖技术组合拳之三：共定位验证

方法：结合RNA-FISH（标记circRNA）和免疫荧光（标记蛋白），在细胞原位观察它们是否在空间上共存。

关键结果：

清晰的共聚焦图像显示，circPOLR2A（绿色）与PEBP1（红色）在细胞质中完美共定位（黄色信号），为它们的相互作用提供了最直观的证据（图3f）。

图3.CircPOLR2A可能与PEBP1蛋白相互作用

发现表型：通过体外实验（CCK-8、克隆形成、Transwell、凋亡实验）和体内动物实验，证实circPOLR2A能促进癌细胞增殖、迁移、侵袭，抑制凋亡。

解析机制：

发现泛素-蛋白酶体途径：当使用蛋白酶体抑制剂MG132后，PEBP1的降解被逆转。Co-IP实验进一步证明，circPOLR2A能增强PEBP1的泛素化修饰（图4a-d）。

锁定E3泛素连接酶：研究者从互作蛋白中锁定UBE3C，并通过Co-IP证明UBE3C是直接催化PEBP1泛素化的E3连接酶。

功能回复实验：通过敲低/过表达目标分子（PEBP1），验证其在表型调控中的必要性。

研究发现，circPOLR2A作为“分子支架”增强UBE3C对PEBP1的泛素化降解，激活ERK通路，促进肿瘤恶性行为。

图4. CircPOLR2A加速了PEBP1泛素/蛋白酶体依赖的蛋白质降解

表观转录组学：如m6A修饰分析（MeRIP）揭示RNA修饰对其稳定性或功能的影响。

调控蛋白识别：如YTHDF2作为m6A阅读蛋白，调控circPOLR2A的表达。

研究者发现m6A阅读蛋白YTHDF2能与circPOLR2A结合（图5a-c），并通过MeRIP实验证实circPOLR2A本身存在m6A修饰（图5f）。YTHDF2通过识别m6A修饰来促进circPOLR2A的降解，从而在正常组织中抑制其水平。而在癌症中，YTHDF2的低表达导致了circPOLR2A的积累，开启了整个致癌过程（图5g-k）。

图5 .敲低m6A阅读蛋白YTHDF2促进了cRCC细胞中circPOLR2A的表达

这项研究为我们提供了一个RNA-蛋白互作研究的典范模板：

目标锁定：生信筛选+实验验证。

身份鉴定：环状RNA特性验证。

寻找伙伴：Pull-Down + RIP + 共定位。

机制深挖：表型分析→翻译后调控探索→酶功能确定→“分子支架”模型验证→信号通路贯通。

上游追溯：揭示RNA自身的表观转录调控。

随着新技术不断涌现，对RNA-蛋白互作的研究必将更加深入。它不仅帮助我们理解生命的基本原理，更为攻克癌症等重大疾病提供了无限可能。掌握这套研究范式，你我都能在微观世界的对话中，聆听并解读出下一个关键的生命密码。