干货|手把手教你做双荧光素酶报告基因检测
2313 人阅读发布时间：2024-09-23 16:22
双荧光素酶报告基因检测是分子互作研究尤其是转录调控研究中十分重要的实验手段，主要应用于启动子和转录因子，以及miRNA和其靶基因互作的验证。
萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）和海肾萤光素酶（Renila luciferase）可分别催化荧光素（luciferin）或腔肠素（coelenterazine）氧化形成oxyluciferin或coelenteramide，并在此过程中产生生物荧光。
在双荧光素酶检测中，首先以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该荧光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾荧光素酶报告基因的活性，具有检测迅速、灵敏度高、检测范围广、无细胞内源活性干扰等特点。
●灵敏度高：比Western blot灵敏度高1000倍以上
●无报告基因：植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达
●不受物质影响：荧光素酶检测不受细胞内其它物质影响
今天，就让小金和您一起，一步一步学会双荧光素酶报告基因检测实验。
首先，我们打开金开瑞的双荧光素酶报告基因检测试剂盒（JKR23008）
注意，除了试剂盒之外，您还需要自备PBS（1X）缓冲液，植物样本还需要准备⼩钢珠或研钵、研磨杵。
将Luciferase Reaction Buffer与Luciferase Reaction Buffer ll从-20°C取出，恢复至室温，保证各组分完全溶解。（注意：Luciferase Reaction Buffer ll如出现沉淀属正常现象，充分震荡溶解后即可使用。）
01.Luciferase Reaction Reagent
按l:49的比例将Luciferase Reaction Substrate同Luciferase Reaction Buffer混合，于30mi内检测裂解物（最好现配现用），剩余试剂建议-20℃或-70℃避光保存。
02.Luciferase Reaction Reagent ll
按l:49的比例将Luciferase Reaction Substrate ll同Luciferase Reaction Buffcr l混合，于30min内检测裂解物（最好现配现用），剩余试剂建议-20℃或-70℃避光保存。
1)贴壁细胞：去除细胞培养基，用1XPBS小心润洗两次，加入适量1 XCell Lysis Buffer，室温充分裂解10分钟后，刮取细胞于1.5mL离心管中。
2)悬浮细胞：收集细胞，300xg离心5分钟，去除培养基。加入适量1 XCell Lysis Buffer，吹打混匀，室温充分裂解10分钟。
3）裂解完成后，2-8℃，12,000xg离心10分钟，取上清待检测。
植物或原生质体样本请参考说明书
吸取10~20μL裂解物至不透明96孔板中，将100μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent加入板中，水平震荡混匀，于化学发光仪（luminometer）中检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性（如果读值封顶建议降低裂解物体积）。之后吸取100μL平衡至室温的Luciferase Reaction Reagent ll加入上述反应管或板中，水平震荡混匀，于化学发光仪中检测海肾荧光素酶报告基因的活性。
① Luciferase Reaction Buffer ll在溶解过程中可能有部分沉淀析出，使用前应充分
需荡或将其置于37°℃水浴锅中，保证其完全溶解后再使用。
② Luciferase Reaction Reagenti和Luciferase Reaction Reagent ll反应前需平衡至
③ 为保证实验数据准确可靠，建议测量大量样品时使用排枪添加Luciferase Reaction
Reagent和Luciferase Reaction Reagent ll,使用过程中务必留意排枪各孔吸取的液体是否一致。
④ Luciferase Reaction Reagent和Luciferase Reaction Reagent ll均易发生氧化反应，请合理安排实验，避免样品解冻后在室温下长时间放置。
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