比导师讲的还详细的ATAC-seq技术
548 人阅读发布时间：2025-06-13 10:47
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）是一种通过高通量测序技术检测染色质开放区域的方法。使用改造的 Tn5转座酶（携带测序接头），靶向插入基因组中开放的染色质区域（即未被核小体紧密包裹的DNA），同时完成DNA的片段化和测序接头的标记，将经转座酶处理的DNA片段通过PCR扩增，构建测序文库并进行高通量测序。
ATAC-seq通过绘制全基因组染色质可及性图谱，揭示细胞类型特异的表观遗传调控机制，目前已广泛应用于发育生物学、疾病研究（如癌症异质性）和药物靶点筛选等领域。
4.与超级增强子鉴定联合分析，明确活性超级增强子的范围
✨高灵敏度: ATAC-seq可以检测到基因组中极少量的可及染色质区域，使其在样本资源有限的情况下也能获得有意义的结果。
✨低样本需求: 由于ATAC-seq需要的细胞数较少，特别是与其他染色质可及性测序技术相比，可在稀有细胞样本中应用。
✨高通量测序: 使用高通量测序技术，ATAC-seq能够同时分析数百万个片段，提供全面的基因组范围数据。
✨直接检测开放染色质: 通过标记开放染色质区域，ATAC-seq直接反映了基因组的可及性，而不需要附加步骤。
✨快速实验流程: 相比传统的染色质可及性测序方法，ATAC-seq的实验流程简化，减少了样本处理时间。
✨较少的偏差: 由于ATAC-seq使用转座酶进行标记，相对于其他方法，它具有较少的偏差，更好地捕获染色质区域的可及性。
✨分辨率高: ATAC-seq可以提供较高的基因组分辨率，更精确地标记和定位开放染色质区域。
✨可提供与其他组学联合分析思路；提供个性化分析方案。
收集目标细胞（新鲜或快速冷冻，确保细胞活性不低于90%，细胞活性至关重要！死细胞会导致背景噪音）。
细胞核提取：将细胞或组织样本加入裂解液，冰上孵育使细胞膜通透，然后离心去除上清，加入PBS重悬细胞核。
细胞核计数：取适量细胞核悬液，加入台盼蓝溶液染色，用血球计数板在显微镜下计数，计算细胞核浓度。
配置反应体系，将透化后的细胞核与预加载了接头的Tn5转座酶混合。在适宜温度（通常37°C）下孵育（30-60分钟）。Tn5转座酶优先结合并插入到染色质结构开放、无核小体占据或核小体疏松的区域。在插入位点两侧切割DNA双链。同时将预加载的测序接头连接到被切割的DNA片段两端。
DNA提取：使用DNA富集beads进行全回收，80%乙醇清洗两遍，晾干2min左右，避免磁珠过于干燥导致回收率偏低，然后溶水回收
PCR扩增：使用包含测序平台（如Illumina）所需完整接头的引物进行PCR扩增。
冰上配制扩增mix，主要为测序引物Index和扩增酶， PCR引物上带有独特的样本索引序列，使得多个样本的文库可以在同一个测序通道中进行混合测序，之后通过索引区分样本。
再次纯化：PCR后使用磁珠纯化扩增产物，去除引物二聚体等杂质。
使用高灵敏度仪器定量和质控文库，检测文库浓度和片段大小分布是否符合预期。
目的：对文库中的DNA片段进行大规模并行测序，获得片段两端的序列信息。
建议使用配对末端测序，可以获得更多的序列数据带来更好的比对结果，PCR重复的识别更加准确。
测序深度：取决于参考基因组的大小和预期的开放染色质程度
一般推荐：常规细胞系/组织样本：30-50 Million (M) 有效比对 reads
稀有细胞类型/单细胞ATAC数据整合：可能需要更深（>50M）
单细胞ATAC-seq：每个细胞通常几千到几万条reads，但总reads量巨大
◆数据基本处理与质控：对原始数据进行过滤，去除接头信息、低质量碱基和未测出的碱基，获取有效数据（Clean Data）
◆各样品基因promoter（up2K）区测序深度分布
◆样品间差异peak相关基因的GO和KEGG富集分析
这篇文章发表在Nature Plants（IF：15.8），通过多组学策略（ATAC-seq、RNA-seq、CUT&Tag）揭示染色质动态与基因表达的协同作用。并确定了关键转录因子和潜在的转化效率增强子。
为了连接转录因子和靶基因，研究者使用 ATAC-seq 数据确定了足迹。大多数足迹分布在 ATAC-seq 峰的中间，宽度为 10 - 50 个碱基对，其中一半可以与拟南芥的转录因子结合基序相匹配。正如预期的那样，足迹的序列比基因间区域的序列更保守。对差异足迹的分析显示，参与植物再生的已知调节因子（如 LEC2、DOF5.6、WOX11 和 BBM）的转录因子活性发生了显著变化，表明它们潜在的功能重要性。
为了确定基因表达的时间顺序，研究者进行了拟时间分析，发现转录因子和靶基因在再生过程中表现出相似的转录谱。每个聚类中的转录因子调节同一聚类中的靶基因。在 C1（在第 0 天特别高表达）与其他聚类之间没有观察到调控关系，这进一步强调了生长素处理的影响。有趣的是，发现 C5 - C6 - C2 - C3 - C4 聚类之间的调控关系遵循基因表达的时间线。
Figure a: 在不同感应阶段的LEC2，DOF5.6，WOX11和BBM的ATAC-SEQ足迹；活动评分反映了染色质的可及性。
Figure 4 b:不同的RNA簇之间的调节关系（Fisher的精确测试，p.adj < 1e-6)）。
Figure 4c：TRN中TF和目标的表达模式， TFS与目标之间的调节关系已在拟南芥中证明。（来源于文献：Uncovering the transcriptional regulatory network involved in boosting wheat regeneration and transformation. Nat Plants）
ATAC-seq是一项革命性的技术，以其简便、灵敏、高分辨的特点，成为绘制染色质可及性图谱、解析基因调控网络的强大工具它在基础生物学、发育、疾病机制和精准医疗等领域发挥着越来越重要的作用。该技术无需抗体或复杂交联步骤，显著节省时间成本，而且可精准定位开放染色质区域（分辨率达单碱基水平），识别转录因子结合位点及核小体排布，适用于微量样本（低至500~50,000个细胞），尤其适合珍贵临床样本或单细胞分析。金开瑞可以提供ATAC-seq、ChIP-seq和CUT&Tag技术服务，期待与您携手合作，共同推动生命科学的发展。 
