一、GST pull down 实验简介

    GST pull down是常用的蛋白与蛋白互作实验方法，利用带有标签的已知蛋白作为诱饵蛋白（最常用的是GST标签，即谷胱甘肽巯基转移酶，glutathione S-transferase），诱饵蛋白特异性结合谷胱甘肽亲和树脂，当目的蛋白溶液过柱时，将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白复合物捕获。复合物洗脱后，通过蛋白凝胶电泳分析两种蛋白间的相互作用，或者筛选相应的目的蛋白。

 

二、应用背景

    通过蛋白-蛋白互作的研究技术GST pull down这个实验，研究人员能够探究蛋白质之间的相互作用，揭示细胞内复杂的信号传递和调控网络。这不仅有助于我们对疾病发生机制的理解，还为药物研发和治疗策略的开发提供了重要的参考。

 

三、GST pull down原理简介

 

四、pull down实验流程

（1）蛋白提取与蛋白浓度测定；

（2）pull down前WB检测诱饵蛋白及猎物蛋白的表达；

（3）pull down实验，包括以下步骤：

    a.磁珠准备，将磁珠分装且标记为实验组和对照组，用预冷的IP洗涤液重悬磁珠；

    b.磁珠结合诱饵蛋白GST-A（实验组加诱饵蛋白GST-A，对照组加标签GST蛋白），静音混合2h后用预冷的IP洗涤液进行洗涤重悬磁珠；

    c.诱饵蛋白结合互作蛋白His-B（实验组合对照组分别加入His-B或总蛋白），4℃静音混合过夜（约16h）后用预冷的IP洗涤液进行洗涤重悬磁珠；

    d.洗脱；

（4）pull down后WB检测或者MS检测。

 

五、样品类型

1、两个已知蛋白的互作验证

    两个重组表达蛋白需带不同标签，至少有一个带GST或HIS标签，重组蛋白≥200ug，蛋白浓度0.1mg/ml以上，纯度≥85%，上清表达为宜，包涵体表达需做挂柱测试。

2、已知蛋白筛选互作蛋白

    ①重组表达蛋白，带GST或HIS标签（重组蛋白≥200ug，蛋白浓度0.1mg/ml以上，纯度≥85%，上清表达为宜，包涵体表达需做挂柱测试）

    ②总蛋白（提供细胞沉淀或新鲜动植物组织）

 

六、应用延伸

GST pull-down实验的诱饵蛋白除了可以带GST标签外，还可以带HiS标签，则称HiS pull-down实验，也有使用多肽或者化合物进行pull down实验，称为多肽pull-down或者化合物pull-down实验。

 

七、实验常见问题

1、IP、Co-IP、pull-down的区别？

    通常IP或coIP使用组织细胞材料，靶蛋白为内源天然蛋白或组织细胞中过表达蛋白（可融合标签）。Pull-down中的诱饵蛋白一般经重组表达获得。IP和coIP需要使用亲和力好的一抗，选购时需注意相应验证数据。

简单来说，IP捕获目的蛋白，Co-IP捕获目的蛋白和其互作蛋白，pull-down用融合标签的重组蛋白来捕获其互作蛋白。

2、如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？

    蛋白有可能表达在上清也可能表达在包涵体中，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本是可溶的；如果超声之后，菌液是浑浊的，而且在离心后沉淀比较多，且沉淀的颜色也比较白，蛋白基本就是在表达在包涵体中了。

3、如果蛋白表达在包涵体中是否可以进行后续GST pull down实验？

    包涵体，就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使其变性，解聚后再尝试。

 

八、案例分享

Mitophagy associated self-degradation of phosphorylated MAP4 guarantees the migration and proliferation responses of keratinocytes to hypoxia

期刊：cell death discovery

IF：7.109

发表时间：2023/5/17（文章中材料和方法提到金开瑞）

C The direct interaction of GST-LC3 and HIS-MAP4-1 (1–170 aa) measured by GST pull-down. n = 3. D The direct interaction of GST-LC3 and HISMAP4-2 (398–547 aa) detected by GST pull-down. n = 3. E, F The direct interaction of GST-LC3 with MAP4-1 Mut1△34,37 or MAP4-1 Mut2△47,50

detected by GST pull-down. n = 3.