问双荧光素酶报告基因实验转染效率很低而且复孔重复不出来？
答转染效率低的话可以从三个方面改善，首先要确保细胞状态是好的，通常我们选出处于分裂期的细胞，另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒，还有就是DNA的质量尤为重要，最好是先酶切验证。

这个实验检测结果很灵敏，有一定差异是正常的，通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从以下两方面改善:

1、细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性；

2、保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准。

 

问
荧光值过低或无荧光值

答1. 启动子活性低

a.优化细胞的培养条件，提高荧光素酶的表达量；

b.更换强启动子（如SV40、CMV）。

2. 转染效率低

a.优化转染实验条件，用较易转染的质粒做阳性对照（如转染过表达荧光蛋白质粒）；

b.确保转染DNA的质量，可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定；

c.选择活性较高，处于指数分裂期的细胞进行转染。

3. 样品裂解效率低

a.细胞培养时间不宜过长，12-36h内最好，长时间培养后，细胞可能会难裂解；

b.加入的裂解液需足量，保证细胞能够充分裂解。

 

4. 检测过程操作不规范

a. 选择合适的检测仪器，如Luminometer 发光计、多功能酶标仪或者其他能够检测生物发光的仪器都适用于该实验；

b.需加入足量底物，保证底物的饱和，否则会造成检测结果出现很大偏差；

c.室温反应。酶促反应对温度较为敏感，反应时各个组分（细胞裂解产物，底物工作液等）都需要调整到室温（20-25℃）再使用；

d.荧光素酶的半衰期一般约30min，加完底物后可立即检测，尽量在30min内完成；

e. 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光白色酶标板。黑色酶标板也可用，但因黑色会吸收光信号，可能会降低信号。

 

5. 底物氧化失效

a.底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20℃保存；海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存；

b. 反应工作液建议现用现配。

 

问

如何判断实验体系无异常，获得客观的实验结果？
答可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性：

1. 对照的2个实验组，即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异；

2. 转染正常，质粒或mimic确保成功转染入细胞；

3. luc检测值在仪器检测线性范围内。

 

问

如何判断转染成功？
答1. 如转入的miRNA带荧光标记如GFP，则可直接在转染后、细胞裂解前，显微镜下观察细胞荧光；

2. 如转入的miRNA不带任何荧光标记，可考虑进行miRNA的qRT-PCR检测，通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达；

3.设置一个荧光质粒转染参照组，同批转染一个组的细胞，间接反映出同批次实验的转染情况。

 

问

荧光素酶作为报告基因相比于荧光蛋白有哪些优势？
答Luciferase的灵敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同时具有更宽的动态范围，便于数值分析比较，不需要荧光显微镜，而且在活体实验中其荧光穿透性高于EGFP等荧光蛋白，同时由于没有内源活性、其本底信号很低。而GFP等荧光蛋白相比于荧光素酶的优势在于可以进行失踪定位，并且其观测不需裂解细胞，方便进行适时观察。

 

问

质粒的荧光会干扰双荧光素酶的测定么? 和PGL3共转染的质粒是GFP，GFP的绿色荧光会影响以萤火虫为底物的荧光么？
答不会干扰，不会影响。

萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，波长540-600nm，一般检测时选用560nm。

海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光，波长460-540nm，一般检测时选用460nm。

不同于绿色荧光蛋白（GFP）需要一定的光激发才能发光，且易淬灭；荧光素酶经过反应本身就可以自发荧光，并且只有在底物存在时才能发光。因此GFP只能用于标记或检测反应是否发生，而荧光素酶报告实验却能通过荧光值定量分析荧光素酶的表达水平。

 

问
荧光值过高

答荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决：

a. 减少质粒转染量；

b. 细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。

注：不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。

 

问

复孔重复性差
答可能原因及解决方案如下：

（1）实验平行复孔（不同细胞孔）：不同孔之间的数值影响因素较多。建议做同一个细胞孔裂解液的技术性平行来检测试剂重复性。

（2）来源于同一个细胞孔的裂解液复孔：注意实验操作、加样顺序、加样速度及加样量。检查排枪加样是否存在不均一问题。

（3）控制不同样品和底物混合后至上机检测的时间间隔尽量一致。

注：荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。

 

问哪里可以看双荧光素酶实验的详细教学视频？
答详见金开瑞生物B站网址：

https://space.bilibili.com/588486221

 

 

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