Skyline是一个免费的开源Windows客户端应用程序，支持构建选择性反应监测（SRM）/多反应监测（MRM）、平行反应监测（PRM-目标MS/MS），数据非依赖型采集（DIA/SWATH）和MS1定量（如label-free定量）的DDA，并对所得的质谱数据进行分析。

本文将详细阐述：如何从数据依赖型串联质谱获得的DDA数据的MS1 谱图中提取时间-强度色谱峰来进行肽段定量。这里先从Skyline软件的下载安装开始，帮助您快速入门，迅速了解该软件一些功能，为以后的深度学习打下一个基础。

 1、下载Skyline软件 

下载网址：

https://skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view

网站界面如下图，点击红色箭头指示的链接下载即可。

  2、安装Skyline 

下载后双击setup.exe可执行文件，根据提示逐步完成安装。

 3、打开Skyline 

双击安装好的Skyline桌面图标，运行后的界面如下。点击“blank document”就可以开始Skyline参数配置及定量分析。

 

4、Skyline配置及定量分析

4.1 肽段设置（Peptides Settings）

4.1.1 创建背景蛋白库（Background proteome）

点击“Settings→Peptide Settings”进入“Digestion”选项卡。蛋白水解酶<Enzyme>为胰蛋白酶，最大漏切数目<Max missed cleavage>一般为2。

在<Background proteome>中构建背景蛋白库，单击下拉框选择<Add>，进入编辑界面。在<Name>中为蛋白库命名，如果是第一次创建背景蛋白库，单击<Create>设置背景蛋白库的存储路径，如果已有现成的背景库，点击<Open>打开。此时<Add File>按钮由灰色转变为激活状态，单击添加Fasta文件。最后单击<OK>完成背景蛋白库设置。

 

4.1.2 构建谱图库（Spectral Library）

蛋白库生成主要用到*.group文件。单击“Library”选项卡，如果已经有现存的谱图库，直接勾选即可，否则单击<Build>进入谱图库构建界面。

在<Name>中为谱图库命名，在<Output Path>中选择谱图库的保存路径。勾选“Keep redundant library”可选框，保留冗余库，目的是让库中保留尽可能多的谱图信息。填写<Cut-off score>为0.95，即设定FDR为0.05。

单击<Next>进入数据导入界面。单击<Add Files>添加构建谱图库的文件（一般为某种搜索软件搜索完DDA数据后的结果，这里使用的是Proteinpilot软件搜索，所以建库文件是.group），单击”Finish”完成谱图库构建。此步骤一般需要几分钟，先生成与每个*.group对应的*.xml文件，再执行导入，由*xml文件构建谱图库。在<Libraries>中确保本次构建的谱图库被选中，且无其他不必要的库。
 

4.1.3 修饰设置（Modifications）

点击“Modifications”选项卡，在<Structureal modifications>中选择修饰类型，在没有特殊要求的情况下仅勾选以下4种修饰：

Carbamidomethyl (C)

Oxidation (M)

Gln→pyro-Glu (N-term Q)

Acetyl (N-term)

其他设置保持默认。

若<Structureal modifications>中没有想要的修饰，点击“Edit list->Add”构建修饰。<Name>填写修饰名，<Amino acid>指发生修饰的氨基酸，<Terminus>在氨基酸的C端 or N端发生修饰，<Variable>是否是可变修饰，<Chemical formula>填写修饰的化学式，可点击旁边小三角进行选择。完成后点击<Ok>即可。

4.2 离子设置

点击“Settings→Transition Settings”，进入“Prediction”选项卡。

前体离子质量下拉框<Precursor mass>选择单一分子量“Monoisotopic”

子离子质量下拉框<Product mass>选择单一分子量“Monoisotopic”

碰撞能量<Collision energy>选择“ABI TOF 5600”（根据所使用的质谱填写）

去族电压<Declustering potential>择“None”

优化库<Optimization library>选择“None”

补偿电压<Compensation Voltage>选择“None”

点击<Filter>按照下图设置：

点击<Library>按照下图设置：

点击<Instrument>按照下图设置：

点击<Full-Scan>按照下图设置：

现在可以保存整个Skyline文档到.sky。

4.3 定量分析

4.3.1 载入谱图库

点击“View→Spectral Libraries”，进入谱图浏览界面。

较之前的设置而言（4种），谱图库中一般会含有更丰富的修饰类型，所以会提示是否考虑这些修饰，无特殊需求不考虑。

这里展示的是谱图库中所有肽段的信息，勾选<Associate proteins>，关联每一肽段属于哪一个蛋白质，点击<Add All>，即可将谱图库中的肽段导入“Targets”一栏中。

完成后会提示与蛋白质匹配上的肽段数，未匹配上的肽段数以及被过滤掉的肽段数。

单击“OK”跳出对话框如下，会提示总体的蛋白，肽段及离子数目。

在主界面中，左侧<Targets>显示所要研究的目标肽段，右侧显示谱图库信息，若是空白则可点击“View->Library Match”查看。

4.3.2载入DDA数据

点击“File→Import→Result”，进入结果载入界面，选择”Add single-injection replicates in files”，单击“OK”，载入DDA模式下生成的.wiff文件。

完毕，会提示是否去除所有wiff文件名称中开头重复的部分。完成后主界面展示了Targets、各样本DDA模式下母离子的XIC和Labrary Macth。

4.3.3 样本名称更改

点击“Edit→Manage Result”，可用于样品名称更改，以便后期分析。

至此，DDA数据的输入与分析暂时结束,记得点击“File->Save”保存到.sky哦。

4.4 输出定量结果

点击“File→Export →Report”输出定量结果。

可点击“Edit-->Add”，新增一个结果输出的样式，添加想要输出的对象。最后输出肽段定量表（*.csv格式），作为后续分析的主要数据来源。

至此，使用Skyline处理DDA数据的流程就暂时告一段落，现在可以尝试着去构建一个属于自己的Skyline文档了。

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发现蛋白质组学	单一蛋白鉴定	目标蛋白鉴定、蛋白混合物鉴定
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