iTRAQ定量常见问题与解答

1、 iTRAQ定量蛋白质组和2-DGE相比，有什么优势么？确实比2-DGE效果更好么？
        2-DGE是伴随着MALDI-TOF技术发展起来的蛋白质分离技术，理论上可以通过等电点(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差异将总蛋白质逐一分开，实际情况并不理想，因为低丰度蛋白无法染色成功而看不见，蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等，一张2-DGE能鉴定到的蛋白质总数最多～2000蛋白。而iTRAQ是伴随LC-MS/MS技术发展起来的蛋白质组定量技术，不用做双向电泳，同时可以克服2-DGE无法鉴定低丰度和修饰蛋白干扰的情况，一针即可鉴定～2000左右的蛋白(1.5hr)，分组分后，依据不同物种的情况有所差异，一般小鼠肝脏组织的iTRAQ定量可以获得4000～6000个定量蛋白，而人类肝癌细胞系HepG可以获得5000～8000左右的定量蛋白。

iTRAQ的优势不仅仅在于定量蛋白质组的数量，还在于单次实验可以同时做4～8个样本，降低仪器的系统误差，保持高通量定量能力。一般的定量蛋白质组实验，iTRAQ优势远远大约2-DGE，属于两个时代的技术。
2、iTRAQ定量蛋白质组做完实验后，能拿到什么结果呢？可以直接用来发文章么？
      我们目前的iTRAQ定量蛋白质组的实验流程和结果都是受到业内顶级杂志JPR和MCP公认的，可以直接用于文章的发表。客户不仅可以拿到iTRAQ定量蛋白质组中的差异蛋白、蛋白的GO和KEGG归类信息、COG归类、不同样本的差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作蛋白信息等，还可以提供客户指定的分析内容，提供个性化的服务要求，比如转录组和蛋白质组的关联分析。
3、关于“样品重复”，技术重复和上机重复有什么区别？发表的文章一般要求几次重复呢？
       一般建议客户做3次实验重复，如此可以在发表文章的过程中不被editor挑刺，从而影响发文章的速度。一般的文章会要求3次实验重复，如果iTRAQ后续做了大量的WB或ELISA验证，那么，2次实验重复也是必要的；仅作1次实验有风险，因为如果是实验过程出现问题，缺乏结果的评估，往往说服力不够，对文章发表可能构成影响，建议客户最好不要只作1次实验。

技术重复一般和上机重复非常类似，即上质谱的重复，即测试仪器的稳定性，判断系统误差等问题。这一说法主要和质谱仪器的发展进程相关，早期的仪器不是很稳定，同一个样本上机3次，结果差异较大，当前的上机重复仍然在一些JPR和MCP文章中可见，即沿用了早期的习惯。而应用型的文章中，上机重复或技术重复一般没有硬性规定，可以不做，如果做了当然最好，editor就不会再此处找你的问题。
4、iTRAQ、SILAC和SWATH等相比，我更应该选择哪一种定量的方法呢？
        目前主流的定量蛋白质组方法有5种，分别是iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、label-free和SWATH 。其中最流行的是iTRAQ定量蛋白质组方法，该方法不依赖样本，可以做任意样本的总蛋白质的差异定量，而且定量准确，这个层次上label-free虽然也可以做任意样本，但是定量准确度难以保障。SILAC是仅仅适合细胞层次的蛋白质组定量，组织的定量需要摸索或者前人已经摸索的模式，中途测试新组织难度较大，极易失败，细胞层次的SILAC培养费用高昂，不适合做商业化。MRM和SWATH都是目标蛋白质组相关的定量模式，但是SWATH可以完成数千种蛋白的定量，准确度极高，通量远高于MRM，对于亚细胞结构、细菌、真菌、细胞分泌物等样本，SWATH效果非常好，当然，SWATH价格相对较高。SWATH本身对物种没有偏向性，也是目标蛋白定量的一种，定量结果准确，可以和MRM媲美，发文章更具有说服力，但是一次能定量只能达到2000多个蛋白。
5、不同老师的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机？
        有些老师比较了解iTRAQ定量蛋白质组的流程，因此，有此问题。早期的商业服务公司，往往会将不同客户的iTRAQ样本放到一起，如此可以有效的节约成本。

我们的专业决定了我们坚决不会将不同客户的样本混合到一起上质谱。如果客户的样品来自不同物种，那么质谱鉴定的数据库选择会不同，无法进行比较。如果是同一个物种的样品，那么经过不同实验室处理后，样品里的蛋白含量和数目会有较大差别，混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。
6、物种没有测序，能否做蛋白质组呢？
        因为当前大量的物种已经测序，预测了相应的基因，未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究。因此，一般来说，未测序物种可以考虑近缘物种的基因组序列作为数据库，可以做蛋白质组。
7、iTRAQ技术原理是什么？有什么优势？有什么缺陷？
         iTRAQ技术的核心原理是多肽标记和定量，将多肽的含量转化为114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8标记)，从而简化了定量的复杂性，最终通过多肽定量值回归到蛋白的定量值，从而最终测定出不同样本之间蛋白质的差异。

        该技术的优势：多达8标记、系统误差小、直接对二级谱定量、定量蛋白数量更多、标记效率高等。

        该技术的缺陷：应该说这是唯一的缺陷，就是定量不是当前定量技术最准确的，最准确的是SWATH和MRM技术。定量不准确的原因是附近m/z同位素的干扰，这些m/z接近的同位素引入了干扰的4标记或8标记的同位素，最终导致原本差异10倍，而干扰会将10倍变成5倍左右。当然，差异蛋白的趋势是正确的，大量发表的研究论文也证实了这一点。
8、为什么有些差异表达基因在蛋白层面没有相应的差异蛋白？

        这是学术性的问题，不是技术的问题。表达层次即RNA层次，RNA层次和protein层次的不一致性是一个公认的事实，通常相关性只有～0.5左右，即RNA和protein往往是两个不一样的概念。引起RNA和protein差异的原因很多，比如miRNA、lincRNA、circle RNA和E3 ligase等等。
9、iTRAQ技术采用什么型号的质谱仪？采用iTRAQ技术对样品有什么要求？iTRAQ技术适用对象有哪些？

       金开瑞采用的质谱仪是AB Sciex公司的Triple TOF 5600 plus，属于LC-MS/MS。该仪器和Thermo公司的orbitrap是当前能做蛋白质组的两类仪器。

iTRAQ对于每一个样品的蛋白需求最少为50μg，采用4标或8标iTRAQ标记进行的iTRAQ实验，一般来说，分析的样品数量不能少于4个，采用8标标记进行的iTRAQ实验其同时分析的样品数量不能多于8个。

        理论上说，iTRAQ适合任意来源的总蛋白样本，植物、动物、细菌、真菌等等。

        金开瑞采用与Triple TOF 5600 plus配套的proteinpilot。已经有大量使用该软件发表的蛋白质组相关文献，是一款被广泛认可的蛋白质组鉴定、定量软件。我们对鉴定结果要求FDR≤1%，每个蛋白至少包含1个独有肽段。对于定量差异蛋白的评判标准，我们一般按照FC≥1.5，同时p-value≤0.05的标准过滤。
金开瑞ITRAQ定量详细信息：http://www.genecreate.cn/iTRAQ/。