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关于酵母杂交文库构建及筛选你需要知道这些
人阅读 发布时间：2023-09-08 11:53
一、酵母单杂交
酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析 DNA 结合结构域信息等。
酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测蛋白质相互作用的研究方法，因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点，现已被应用于多个研究领域。
核蛋白酵母双杂交：
核蛋白酵母双杂交技术最初由 Fields 等人在研究酵母转录因子 GAL4 性质时建立，后续经过不断改进已发展成为一种成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有简便、灵敏、可反映蛋白在活细胞内互作真实情况的特点，被广泛应用于互作蛋白的筛选、蛋白相互作用的鉴定/验证、蛋白互作机理的探究、蛋白连锁图谱绘制等工作。
膜蛋白酵母双杂交：
DUALmembrane 技术在传统的酵母双杂交系统的基础上，巧妙地利用分离的泛素系统（split-ubiquitin）进行蛋白质相互作用的筛选；泛素作为降解信号分子，人为分成两部分：N 端（Nub），C 端（Cub），互补重构的完整泛素分子可被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。
植物：自交不亲和机理研究……
病毒：朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选……
信号通路：转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选……
癌症医学：癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选……
寄生虫医学：毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选……
基础原理研究：肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育…….
- 一站式辅助检测手段方便快捷，得到可靠的实验结论；
- 多年文库构建经验，4 种优化的 Total RNA 提取技术方案可以有效保证 Total RNA 的纯度和完整性，保证样本的多样性；
- 直接检测蛋白质之间的相互作用，而不依赖于其他分子或细胞的参与；
- 可同时筛选和鉴定多个蛋白质间的相互作用，实现高通量的筛选和分析；
- 采用多个筛选步骤，如报告基因的验证和酵母菌株的双重选择，可以减少非特异性相互作用的假阳性结果；
- 可通过报告基因的表达水平定量评估蛋白质相互作用的强度，进一步了解相互作用的动力学和功能。
1．Q: 酵母双杂交的筛选流程？
A: 将已知基因作为诱饵，在选定的 cDNA 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到 AD-LIBRARY 质粒，对质粒中的 cDNA 片段进行测序，并对该片段的编码序列在 GENEBANK 中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。
2. Q: 酵母杂交技术有哪些优势？
A: a．体内的互作验证，省去蛋白表达、纯化等步骤；b. 细胞内验证，在一定程度上反应细胞内的真实情况；c. 可以检测微弱的蛋白互作；d. 可对不同组织、器官、细胞、分化阶段材料进行文库构建和筛选
3．Q:如何确定是选择构建核体系文库还是膜体系文库？
A: 如果诱饵基因是定位在膜上的蛋白则选择膜体系文库，如果诱饵基因是定位于核则选择核体系文库，如果诱饵基因有跨膜区也可以考虑把跨膜区切除以后用核体系文库筛库，但是这样操作有一定风险。
4．Q: 如果诱饵蛋白能够直接激活报告基因的表达，改如何处理？
A: 该蛋白很可能是转录因子，具有转录激活域。可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活。但是要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
5．Q: 杂交效率不高，怎么办？
A: 在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数，提高杂交效率。
6．Q: 酵母双杂交出现假阳性的原因？如何解决？
A: 由于 BD 融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者其激活作用被外来蛋白激活。AD 融合靶蛋白如果有 DNA 的特异性结合，则也可单独激活报告基因的表达。因此，需要作严格的对照试验，对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定，以排除假阳性。也可以采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同，这可减少大量的假阳性。另外，报告基因整合到染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。
7．Q: 酵母双杂交系统有哪些应用？
A: a．发现新的蛋白质和蛋白质的新功能；b. 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用；c. 筛选药物的作用位点；d. 建立基因组蛋白连锁图
8. Q: 金开瑞酵母双杂交有哪些优势？
A: a．我们会进行自激活及毒性检测；b. 文库构建，我们采用纯化分离 mRNA 材料建库，增加了文库样本的有效性，5’端引物设计保证N端序列的有效性；c. 文库容量达标（>1*107cfu/mL）。
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一、酵母双杂交技术与其他实验方法结合使用，进一步验证和深入研究相互作用的结果。以下是一些常见的与酵母双杂交技术结合使用的实验方法和技术：
● 共沉淀实验（Co-immunoprecipitation）：通过共沉淀实验可以验证在酵母双杂交中发现的蛋白质相互作用是否在真实生物环境中发生。该实验通过特定抗体与目标蛋白质结合，并随后使用免疫沉淀技术将与其相互作用的蛋白质一起沉淀下来，以进一步证实相互作用的存在。
● 免疫荧光染色（Immunofluorescence Staining）：通过免疫荧光染色可以确定蛋白质相互作用的亚细胞定位和动态变化。该技术使用特定抗体与目标蛋白质结合，并通过荧光标记的二抗或荧光标记的蛋白质结合域来可视化相互作用的位置和形式。
● 酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）：ELISA 可以定量测定蛋白质之间的相互作用强度。通过将酵母细胞裂解提取的蛋白质与特定抗体结合，再用标记的二抗和酶底物进行检测，可以测定相互作用的强度。
● 蛋白质结构分析技术：例如X射线晶体学和核磁共振等技术，可以用于解析蛋白质相互作用的三维结构，进一步了解相互作用的机制和结构特征。
● 蛋白质组学分析：通过质谱技术（如质谱联用技术）可以鉴定和定量测定与目标蛋白质相互作用的蛋白质。这种方法可以提供更全面的蛋白质相互作用网络信息。
● 基因表达分析：通过基因表达分析方法（如实时定量 PCR、RNA 测序等），可以确定与目标蛋白质相互作用的基因的表达水平的变化。这有助于了解蛋白质相互作用对基因调控的影响。
● 细胞荧光共定位分析：通过将荧光蛋白标记的蛋白质与目标蛋白质共表达，通过荧光显微镜观察它们在细胞中的共定位情况，可以进一步证实它们的相互作用。
● 组织特异性表达分析：通过组织特异性表达分析方法（如原位杂交、免疫组化等），可以确定与目标蛋白质相互作用的基因在不同组织中的表达模式，从而了解蛋白质相互作用的组织特异性。
● 代谢标记技术：通过代谢标记技术（如蛋白质生物素标记、蛋白质荧光标记等），可以跟踪和定量测定蛋白质相互作用的时空动态变化。
二、研究蛋白质之间相互作用的方法简介、应用场景、优劣势及优化建议
| 方法 |
简介 |
应用场景 |
优劣势 |
优化建议 |
| 酵母双杂交 （Yeast Two-Hybrid） |
利用酵母细胞内的转录激活和检测系统， 筛选和鉴定蛋白质之间的相互作用 |
揭示蛋白质相互作用网络、调控机制、代谢途径等生物过程 | 优势：高通量筛选、生理相关性、定量分析能力； 限制：非自然环境、假阴性结果 |
选择适当的诱饵和猎物构建策略，优化培养条件， 使用高灵敏性检测系统进行验证， 增加筛选步骤和互补技术进行验证。 |
| （Co-immunoprecipitation） |
利用特异性抗体富集目标蛋白质及其结合的互作伙伴 | 研究蛋白质复合物的组成、结构和功能 | 优势：生物相关性、较低的假阳性率、定性和定量分析能力； 限制：特异性抗体的选择、技术复杂性 |
选择合适的抗体，进行前处理步骤以减少非特异性结合， 使用对照实验验证结果，结合其他技术进行互补验证。 |
| 表面等离子体共振 （Surface Plasmon Resonance，SPR） |
监测蛋白质结合到传感芯片表面的光学信号变化 | 评估蛋白质结合的动力学、亲和力和特异性 | 优势：高灵敏度、实时监测； 限制：设备和实验技术的要求 |
选择适当的传感芯片和结合条件，优化实验参数和流速， 增加对照实验和质控步骤，优化数据分析和解释。 |
| 核磁共振 （Nuclear Magnetic Resonance，NMR） |
通过测量核磁共振谱来研究蛋白质的结构和相互作用 | 研究蛋白质的折叠状态、结合界面和动态变化 | 优势：高分辨率、提供结构和动态信息； 限制：设备和技术要求、样品的制备和稳定性 |
选择适当的标记方式和溶剂条件，优化样品纯度和浓度， 选择适当的NMR实验方案，优化数据采集和处理以提高信噪比。 |
| 光学显微技术 （Fluorescence Microscopy） |
观察蛋白质在细胞内的动态分布和相互作用 | 研究蛋白质相互作用的时空动态、细胞信号传导和调控机制 | 优势：实时观察、非侵入性； 限制：需标记蛋白质、分辨率和深度的限制 |
选择合适的标记方法和探针，优化成像条件和细胞处理步骤， 使用高分辨率成像系统和图像分析软件进行定量和定性分析。 |
| GST pull-down |
利用GST-融合蛋白将目标蛋白质及其结合的互作伙伴富集， 通过亲和纯化和检测来分析相互作用 |
鉴定蛋白质相互作用、筛选结合伙伴、研究蛋白质结构和功能 | 优势：简单易行、高纯度富集、适用于大规模筛选； 限制：需蛋白质的表达和纯化、可能存在非特异性结合和假阳性 |
优化选择合适的GST标签和亲和纯化条件， 进行对照实验和负对照实验， 结合其他技术进行互补验证， 使用高灵敏性检测方法进行验证。 |
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