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答疑|双荧光素酶报告基因服务咨询汇总

发布时间:2019-11-15 14:47 |  点击次数:

最近小编收到很多老师咨询双荧光素酶报告基因服务的留言,现选取了几个共性问题给大家回复一下~
Q : 您好,我们实验室的学生做双荧光素酶报告基因实验转染效率很低而且复孔重复不出来,想咨询一下原因
A : 转染效率低的话可以从三个方面改善,首先要确保细胞状态是好的,通常我们选出处于分裂期的细胞,另外阳性对照您可以选择过表达的荧光蛋白质粒,还有就是DNA的质量尤为重要,最好是先酶切验证。
这个实验检测结果很灵敏,有一定差异是正常的,通常只要确保它在一个数量级之内即可。如果差异超出这个范围可以从两方面改善,一是记住保持样本的均一性,二是加样要准确。

Q : 样品裂解效率低怎么解决呢?
A : 首先要确保实验者加入了足够的裂解液,其次就是细胞培养时间最好不要超过36小时,因为培养时间过长会加大裂解难度

Q : 海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶相比,相对活性如何?
A : 在氧、镁和ATP的存在下,萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素,而来源于海洋腔肠(Renilla reniformis)的荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。双报告基因技术(Dual-reporter assays),结合了萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试。

Q : 海肾荧光素酶载体有哪些?
A : 有4个不同的载体,pRL-SV40 载体、pRL-CMV 载体、pRL-TK 载体、pRL-null 载体。

Q : 双荧光素酶报告基因服务应用方向?
A :1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体,再共转入该microRNA,如果萤光素酶活性下降,则提示为其靶序列。
2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域,检测萤光素活性。
3.启动子结构分析。将启动子区域序列(通常2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入luciferase报告载体,检测其启动子活性。
4. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
5. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。
6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如,在GPCR研究中,将cAMP response element(CRE)载入报告基因载体,构建稳定表达细胞株后,可以用于分析GPCR的激活与抑制剂筛选。又如,将HIF1α的响应原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase报告载体构建稳转细胞株,可以用于低氧相关通路的研究。

Q : 可以介绍一下贵公司的双荧光素酶报告基因服务吗?

A : 双荧光素酶报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测,通常一个报告基因作为内对照,使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞,带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子,研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关,偶联到组成型启动子的第二个报告基因,提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法,可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性,如培养细胞的数目和活力的差别,细胞转染和裂解的效率。

Q : 请问贵公司的服务流程是怎样的?
A : 我们的公司的服务流程依次是接受订单及样品、序列分析、合成或扩增目的片段亚克隆至目标载体 、293T细胞共转染pGL3-basic、pRL-TK质粒、荧光素酶反应发光检测 、结果分析。

Q : 如果让你们做,我需要提供什么呢?
A : 您需要提供:1.基因模板,需提供详细的转录因子、目的基因或microRNA信息;2.实验细胞,如无特殊要求,金开瑞默认为使用293T细胞,则无需提供。

Q : 最终实验做完了,你们给我的实现结果包括哪些?
A : 实验流程及完整报告一份,包括实验原始数据、图片、分析结果等。