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技术贴|史上最全IHC攻略，这谁顶得住？
人阅读 发布时间：2019-10-30 13:53
金开瑞定制抗体的IHC验证图
金开瑞专注于抗体定制多年，一站式的抗体服务、多样性的宿主系统、规模化的生产、严格的质控标准，使得金开瑞的定制抗体稳定可靠，满足客户的应用需求，深受国内外客户的欢迎。
一张漂亮的IHC图是怎么诞生的？实验过程中我们应该注意些什么呢？
话不多说，直接上干货，现在小编就跟大家分享IHC 实验中可能出现的各种问题及应对策略，希望给科研君的实验带来实实在在的帮助~
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| 问题 | 原因 | 解决方案 |
| 边缘效应 | 组织边缘贴附不牢，边缘组织松脱漂浮于液体中 | APES/多聚赖氨酸处理玻片；组织切片尽量薄；尽量避免选用坏死较多的组织 |
| 试剂未充分覆盖组织 | 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织 | |
| 非特异性染色 | 抗体质量问题 | 使用质量有保证的抗体 |
| 抗体孵育时间长 | 减少孵育时间 | |
| 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 | |
| 一抗为多抗 | 使用单克隆抗体 | |
| 内源性过氧化物酶及生物素 | 延长灭活时间 | |
| 封闭不足 | 延长封闭时间 | |
| DAB孵育时间过久或浓度过高 | 按说明书配置试剂，镜下控制反应时间 | |
| 抗体孵育后洗涤不充分 | 每次孵育之后洗3*5次 | |
| 实验过程干片 | 及时滴加试剂 | |
| 阴性结果 | 抗体浓度及质量 | 选择有质量保证的抗体，先做预实验摸索抗体使用浓度 |
| 抗原修复不足 | 摸索合适的抗原修复方式及修复时间 | |
| 封闭时间过长 | 减少封闭时间 | |
| DAB孵育时间短 | 镜下控制显色时间 | |
| 细胞通透不全，抗体未能进入细胞反应 | 选择合适的通透剂及其反应时间 | |
| 一抗二抗不匹配 | 选择正确来源的二抗 | |
| 脱片 | 玻片未处理好 | 玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理 |
| 切片厚薄不均匀 | 更换刀片；调整好切片机状态 | |
| 烤片时间或温度不够 | 60℃ 2小时 | |
| 组织自身问题 | 肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片 | |
| 抗原修复时温度迅速变化 | 抗原修复后让其自然冷却 | |
| 染色弱 | 抗体浓度低，孵育时间短 | 提高抗体浓度，延长反应时间 |
| 试剂使用超过有效期 | 试剂定时更新 | |
| 滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释 | 滴加试剂前尽量减少残余液体 | |
| 封闭过度 | 减少封闭时间 | |
| 着色不均匀 | 切片厚度不一致 | 更换刀片；调整好切片机状态 |
| 剂配制未混匀使局部浓度不一致 | 试剂充分混匀后滴加 | |
| 试剂未完全覆盖组织 | 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织 | |
| 脱蜡不完全 | 更换脱蜡剂或延长脱蜡时间 |
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